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等电聚焦电泳色谱仪分离技术

2022-06-24 来源:仁怀市机械信息网

等电聚焦电泳色谱仪分离技术

等电聚焦电泳色谱仪是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同,在一个稳定、连续和线性的pH梯度中进行分离。按pH梯度的形成原理不同可分为载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳和固相pH梯度等电聚焦电泳。一、载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳:1、理想的载体两性电解质应具备的条件:载体两性电解质是两性分子,使其在电泳柱中能达到一个平衡位置。载体两性电解质可作为载体,但两性电解质不能用于等电聚焦。只有载体两性电解质,即具有好的导电和缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。(1)易溶于水,在pI处应有足够的缓冲能力,形成稳定的pH梯度,不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。(2)在pI处应有良好的电导和相同的电导系数,以保持均匀的电场。(3)分子量小,易与被分离物分开。(4)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,也无变性作用,其化学组成不同于蛋白质。2、蛋白质的等电点(pI):蛋白质较主要的特性是它的带电行为,在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电,只是在某一pH时,蛋白质的净电荷为零,此pH即为该蛋白质的等电点(pI)。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象,是一个物理化学常数。3、载体两性电解质pH梯度的载体:常用载体是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶等,其中聚丙烯酰胺凝胶较为常用。4、载体两性电解质pH梯度的介质:一般采用氨基酸和氨基聚合羧酸的缓冲液。5、载体两性电解质pH梯度的形成:等电聚焦电泳的关键是pH梯度的形成,载体两性电解质pH梯度的介质是两性分子,在电场中迁移到自己的等电点后自然形成pH梯度。在没有电场时,载体两性电解质的pH值约是该溶液pH范围的平均值,所有载体两性电解质分子都荷电。当引入电场时,载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移,带有较低等电点的分子(荷负电较多)将较快地向阳极移动,当它达到净电荷为零的位置时才停止,这个位置靠近阳极,由于它具有高的缓冲能力,使环境溶液的pH等于分子本身的pI。一些低pI的载体两性电解质(荷负电次多)也向阳极移动,直到它的净电荷减少到零时才停止。同样,其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推,所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极和阴极之间到达自己的位置,从而形成pH梯度。6、工作原理:蛋白质的等电点取决于其氨基酸的组成。组成每一种蛋白质、多肽的氨基酸的数目和比例不同,蛋白质的等电点范围很宽。在电泳仪中加入载体两性电解质,通直流电时,载体两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。蛋白质进入时,不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH位置上,从而使不同等电点的蛋白质得以分离。7、特点:(1)优点:1)属于非变性蛋白质分离技术。2)分辨率高,区带清晰且窄,分辨率至少可达0.01 pH单位。3)受溶质扩散影响小,可消除分子扩散引起的分离度下降。4)加样部位自由,重现性好。5)操作简单,电泳速度快。6)可测定蛋白质和多肽的等电点。7)分离在较低的工作电压下(20V/cm)进行,可避免蛋白质上专一结合(以共价键等强作用力结合,一定程度上依赖于蛋白质构象)的金属在电场作用下丢失。这部分金属大多构成蛋白质的活性中心或结构中心,比非专一结合金属具有更重要的生物学意义。(2)缺点:1)载体两性电解质合成过程复杂,影响蛋白质点的位置,从而影响重复性。2)凝胶灌制重复性差,影响结果重复性。3)负极漂移现象使pH梯度不稳定。4)负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦。5)需无盐溶液,不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。6)载体两性电解质的加入对产品产生污染。7)操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象。8、载体两性电解质pH值梯度不稳定的原因:阴极漂移是指在等电聚焦电泳中pH梯度的碱性端逐渐消失的过程。反之,如果其酸性端逐渐消失则称为阳极漂移。为了阐明等电聚焦电泳中pH值梯度不稳定的机制,提出了各种假说:(1)载体两性电解质向阴、阳极的等速电泳迁移。(2)在阴极因CO2的吸附而引起阴极液组分和浓度的变化。(3)在pH梯度的中性区域生成一段纯水,水的等电聚焦导致水在电泳柱中的聚集并向两端反流。(4)不同等电点的载体两性电解质的选择性缺陷而引起不稳定。(5)载体两性电解质带电配体的结合或分离而引起不稳定。(6)载体两性电解质相互反应的存在而引起不稳定。(7)相对迁移的氢离子和氢氧根离子浓度的不平衡。9、注意事项:(1)pH梯度的选择。(2)添加中性载体两性电解质。(3)电流降到较小且恒定时尽快结束电泳。(4)电泳结束后,检测凝胶表面pH。(5)蛋白质在pI处形成沉淀,添加表面活性剂。二、固相pH梯度等电聚焦电泳:固相pH梯度等电聚焦电泳比载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳具有更高的分辨率,更大的上样量,其分辨率可达0.001pH,是目前分辨率较高的电泳方法之一。1、工作原理:蛋白质分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中迁移,达到自己的等电点时停止迁移。2、固相pH梯度的介质:固相pH梯度(IPG)的介质是Immobilines试剂,是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物,聚合行为与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺相似。3、固相pH梯度的形成:Immobilines试剂的分子式为CH2 = CH-CO-NH-R,其中R代表羧基或第三氨基,每个分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连。分子一端的双键可在聚合过程中共价键合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中,是固相的,即使是在电场中也不会漂移。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团,利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围,可形成近似线性分布的pH = 3~10的缓冲体系。通过这种方式形成的固相pH梯度胶条不会发生电渗作用,可进行特别稳定的等电聚焦电泳分离。固相pH梯度介质不是两性分子,在凝胶聚合时便形成pH梯度,不随环境电场条件的改变而改变。4、固相pH梯度的选择:常用方法是先宽后窄,先线性后非线性,先短后长,通过实验确定。5、固相pH梯度胶条的泡胀:泡胀的实质是让样品能完整以可溶形式进入固相pH梯度胶条内,从而能进行等电聚焦电泳分离。6、聚焦时间的优化:理论上讲,获得较好的电泳谱图质量和重复性所需的较优时间是等电聚焦电泳分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短,会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽不会导致蛋白质向阴极漂移,但由于活性水转运会导致过多水在固相pH梯度胶表面渗出(电渗),而造成蛋白质谱图变性,在胶条碱性端产生水平条纹和蛋白质丢失。实际工作中,应根据蛋白质样品、上样量、pH范围和胶条长度,通过实验确定较优时间。7、影响固相pH梯度胶条的蛋白质载样量的因素:(1)待分析蛋白质的量应满足质谱分析。(2)如果只是为了得到一张好的电泳谱图,则无需考虑太多其它因素。(3)待研究蛋白质的丰度。(4)对于较复杂的样品,为了尽可能了解所包含的每种蛋白质,需要反复实验才能完成。如果将待测样品富集,则更易分析。(5)固相pH梯度胶条的pH范围。8、特点:(1)优点:1)固相pH梯度可窄至0.1pH,分辨率极高,可达0.001pH。2)pH梯度稳定,不漂移。3)灵活性大,可随意选择pH梯度和斜率。4)重复性好。5)加样量大。6)样品中盐的干扰小。对碱性蛋白质能很好的分离,无边缘效应,可用很窄(如5mm宽)的胶条聚焦,特别适合于双向电泳的第一相。(2)缺点:1)固相 pH梯度灌胶技术复杂,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。2)电泳时需用高电压,电泳时间长。3)窄范围pH测定困难,只能计算。9、注意事项:(1)温度:20~30℃。(2)电压:梯度上升。(3)需无盐溶液,不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。三、应用:分离对象只限于蛋白质和其它两性分子。常用于同工酶的分离分析和pI测定。

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